1]陈勇,李柠岑,陈波,郭义,陈泽林,公一囡,单凯,王美娟.针灸网络生物学[J].中华中医药杂志,2021,36(11):6288-6293.

摘要：针灸起效作用机制是针灸研究的关键科学问题。目前，基于还原论进行的针灸描述性、验证性研究取得了大量的成果，但这些研究多为线性研究，研究两点之间的因果关系，而对针灸的网络调节作用尚未有清晰的认识和深入的研究。文章从制约针灸临床和基础研究的瓶颈入手，客观分析了导致现有问题的原因，总结了针灸基本特点与网络生物学研究模式的共同之处，提炼总结出针灸网络生物学的概念及基本研究内容，并阐述了从外泌体入手进行针灸网络生物学研究的科学性，希望可以为解决针灸研究中的关键科学问题和提高针灸临床疗效提供创新思路与方法依据。

关键词：网络调节；网络生物学；针灸网络生物学；针灸学

背景

针灸疗法是中华民族的瑰宝。针灸属于体表物理疗法，针灸物理刺激这一固有属性，决定了其治疗过程及作用机制是复杂的。目前，国内外学者从神经、免疫、内分泌等不同角度开展了针灸基础研究，涉及器官、组织、细胞、蛋白、基因等多个层面。目前针灸研究也大多采用还原论方法进行研究，从某一点深入研究，找到了部分关键环节或因素，揭示了针灸起效过程中的部分因果关系，但未能全面系统阐释针灸作用原理，还有很多“因”未发现，而且大部分研究只是基于因果模型解释现象，难以转化与预测。这种还原论思维在针灸研究中日益凸现出其局限性，亟需新的研究模式引入到针灸研究当中。

在21世纪之前，生物学研究主要依靠还原论的模式，将复杂的系统化解为各部分组合来加以理解和描述，研究生命运动的理论和规律。生命科学的还原论研究为我们提供了关于单个细胞成分及其功能的丰富知识。然而，独立的生物功能并不能归因于单独的分子，大多数生物学特性产生于细胞的许多成分之间的复杂相互作用，如蛋白质、DNA、RNA和小分子等，这些成分的相互作用有助于激活细胞的结构和功能。如何理解复杂的细胞间相互作用网络是生命科学研究中的重要命题。基于此，Barabaosi AL等提出了“网络生物学”的概念，他们认为通过构建网络模型，可以分析复杂生物系统的相互作用关系和特性。网络生物学是用生物网络描述研究对象的生物学性质、分析因果关系、认识生命活动规律的科学。其主题包括网络构建、网络拓扑、子网络识别和网络动力学；其对象包括单个分子、两两相互作用、局部结构和整体网络；生物网络主要包括转录调控网络、基因调控网络、蛋白相互作用网络、代谢网络和信号网络等。网络生物学的研究内容包括单个分子，也涵盖整体网络，是系统论和还原论相结合的典型代表。生命体系是一个整体的、网络的、复杂的系统，网络生物学的研究模式正符合生命体系的特点，将系统论和还原论结合起来, 将整体与局部结合起来，能更加全面地认识生命体系的本质。

网络生物学将局部与整体结合的研究模式符合针灸网络调节的特点，利用网络生物学的方法研究针灸的基础问题，可以更加全面了解针灸的作用过程，这也就促使了针灸网络生物学的创立。针灸网络生物学将网络建模方法引入到针灸研究中，必将为针灸研究开辟出一种新的研究模式与思路，将基础实验数据进行建模，可以从整体上把握针灸作用规律及作用机制，以点带面，实现对针灸作用过程更加全面的认识。

针灸网络生物学的创立，是解决针灸临床和基础研究瓶颈的客观要求

近10年来，针灸临床研究得到了快速发展，国际针灸界出现了不少高质量的临床研究证据，并被多个国际临床实践指南所纳入推荐。然而，多项发表在《JAMA》《Ann Intern Med》等国际医学顶刊的研究表明，针灸在肌纤维痛、慢性膝关节疼痛、绝经后潮热、多囊卵巢综合征、试管受精的成活率等疾病中出现阴性结果。究其重要原因之一是针刺治疗组未考虑针灸操作的复杂性，安慰对照组未考虑机体经络系统的网络性。严格的随机对照试验要求两组间各个因素的一致性。针灸临床疗效的组成，与众多因素有关，如疾病性质、病位、腧穴、刺法、工具、患者年龄、机体状态、接受度、期望值等。有经验的针灸医师会根据不同的因素，灵活选择腧穴与刺灸法，确定最佳的治疗方案。但受随机对照试验设计所限，治疗组选择的主体方案是固定不变的，这就很难体现出针刺的实际疗效，降低了针刺治疗的效力，因此“真针不真、真穴不真”。安慰对照设计也存在“假针不假、假穴不假”的问题，现在的安慰对照主要包括治疗穴位浅刺、非治疗相关穴位正常针刺、非经非穴正常针刺、非经非穴浅刺、非经非穴深刺等。可以看到，安慰对照的主要通过是否刺入、刺入深度、刺入部位（治疗穴位、非治疗相关穴位、非经非穴）来进行设计。因为经络是网状立体结构，当进行浅刺时，同样可能会使机体产生反应，很难保证安慰组没有治疗效应。同样，当设置非治疗相关穴位或非经非穴时，也很难保证安慰组没有治疗效应。针刺治疗组未体现出针刺的实际疗效，而安慰对照却可能存在一定的治疗效应，这就是出现针灸阴性结果（组间差异无统计学意义）的重要原因。针灸临床研究存在的瓶颈主要是，现有的临床设计未充分考虑针灸网络调节这一固有特点。

从20世纪80年代开始，针灸基础研究发展迅速。针灸基础研究中同样存在着问题，现在的针灸基础研究存在重验证性研究轻预测性研究、重线性研究轻网络研究等问题。重验证性研究轻预测性研究主要表现为大多数针灸基础研究根据中医理论验证影响针刺疗效的关键因素或经络现象的存在，但对疗效预测、临床应用新拓展研究相对较少。如，很多针灸基础研究影响针刺疗效的关键因素，包括经穴因素：经穴-脏腑相关、穴位特异性、腧穴配伍等；针刺因素：针刺手法、针刺深度、刺激参数等；疾病因素：机体状态、优势病症、适宜病症等。验证性研究更多的是研究中医古籍中的针灸和经络现象，例如针刺手法研究和腧穴配伍研究等，但是在针刺手法和腧穴配伍该如何回归临床及提高临床疗效，目前尚无突破性进展。重线性研究轻网络研究表现为针灸基础研究更多应用还原思维关注“干预-效应”两点之间的线性关系，忽略针灸作为复杂干预产生的整体网络调节作用。例如，2010年发表在《Nature Neuroscience》的一篇文章指出，针刺可以通过调节穴区腺苷的分泌，达到针刺镇痛的效应。但是，针刺起效并非只有腺苷的功效，研究表明针刺引起穴区微环境中神经兴奋、细胞功能激活、化学物质释放等化学生物学变化，并与针效相关。针灸起效是一个网络调节的过程，线性研究并不能完全解释针灸的作用机制。

目前，针灸临床和基础研究存在的瓶颈问题主要包括现有研究模式很难体现针灸的网络调节效应以及难以对针灸干预和疗效作出预测。网络生物学可以对既往研究数据进行建模，通过复杂网络分析对各个节点之间关系进行评估预测，因此将网络生物学引入现有针灸研究模式中有利于解决针灸研究的瓶颈问题。针灸网络生物学的创立，可以将针灸研究与计算预测相结合，为针灸的发展提供助力。

针灸网络生物学符合针灸的作用特点和基本模式

《灵枢·根结》云：“用针之要，在于知调阴与阳”，针刺作为一种体表物理刺激疗法，网络调节是其基本作用特点和基本方式，而有别于西药“点-点”或“点-系统”的靶向作用模式。首先，复杂的穴位结构是针刺网络调节的生物学基础。穴位是皮肤、皮下组织、神经、血管、淋巴、肌肉和结缔组织等构成的立体结构。其次，针刺作用原理复杂，涉及多个生命活动过程，是复杂的网络调节过程。针刺效应的产生可分为“感-传-效”3个环节，即从针刺穴区启动，然后沿复杂网络途径传导整合，最后在靶器官发挥针刺调节效应。具体过程就是针刺提插捻转等物理刺激作用于腧穴，使穴区局部的神经兴奋、细胞功能激活（免疫细胞、内分泌细胞等）、相关化学物质（神经递质、细胞因子、激素等）释放，物理信息转化为生物信息，针刺信号在穴位处实现转化并通过穴位经络级联放大，通过神经-内分泌-免疫网络，调节机体内稳态平衡，最后在靶器官发挥治疗效应，见图1。针刺作用于穴位可从多水平、多途径、多靶点发挥生物学效应，通过“针刺信息网络”调控“疾病网络”实现“系统-系统”的整体水平调节，具有网络调节特点，因此，网络调节是针灸的作用特点，也是针灸作用的基本方式。

图1 针刺物理刺激通过神经-内分泌-免疫网络调节机体内稳态平横

注：引自参考文献.A new perspective of acupuncture:The interaction among three networks leads to neutralization

网络生物学以系统论为指导，从整体和系统的角度研究复杂的生物系统，通过基因组学、转录组学、 蛋白组学、代谢组学、表型组学等组学技术从不同层面检测机体的组成成分，获取关键的生物标记物及相关作用途径，建立机体在生理病理过程中的代谢网络，从复杂网络中发现密切相关的生物功能模块和关键的作用节点，可以清晰地揭示机体内生理病理过程中的代谢状况，为更加准确地把握机体内的变化规律奠定坚实基础。针灸作用于人体也是一个复杂的网络整合过程，针灸治疗疾病与其复杂的生物网络调节过程密切相关，针灸治疗疾病往往需要同时调节多个靶点，从不同层次调节疾病的信号通路从而达到治疗疾病的目的。因此应用网络生物学的方法来研究针灸的网络调节过程，符合针灸的作用特点和基本模式，最有可能揭示针灸的作用机制。

针灸网络生物学的基本研究内容

针灸网络生物学是以“数字针灸学”和“计算针灸学”为基础创立的针灸新学科。数字针灸学是由中国针灸学会会长刘保延教授提出的针灸研究的“新基建”，数字针灸学是以古今中外针灸研究文献以及针灸实验研究数据为基础构建的针灸大数据平台，是针灸研究中的“硬件”。计算针灸学是由天津中医药大学郭义教授和天津大学王江教授共同提出，在数字针灸学基础上对针灸大数据进行数学模型构建，以及应用计算科学进行深度计算，研究针灸基础理论、作用规律、作用机制的一门学科，是针灸研究中的“软件”。针灸网络生物学是建立在“数字针灸学”和“计算针灸学”基础上的分支学科，针灸网络生物学以科学问题为导向、以网络数据为驱动，以计算、实验为工具，全面探索针灸作用规律，系统揭示起效机制，预测针灸治疗最佳方案以及针灸临床新应用。

针灸网络生物学可以通过构建“针灸网络-疾病网络”阐明针灸网络调节机制。“针灸网络”的构建主要基于两方面：①基于文献的针灸生物信息数据库：以现有针灸文献和相关生物信息数据库为基础，构建针灸（包括穴位、作用方式、刺激参数等）、效应（包括基因、蛋白、通路、核团反射等）等相关的针灸网络；②基于实验的针灸生物信息数据：通过基因组学、表观组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等高通量组学技术检测针灸作用效应信息，以及在临床实践过程中产生的海量医学数据，构建基于原始数据的真实世界针灸网络。“疾病网络”主要基于国际公认的人类疾病数据库，例如OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/）、GeneCards（https://www. genecards.org/）、GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）等，构建疾病-蛋白-基因网络。在构建“针灸网络”与“疾病网络”基础上，通过计算针灸作用靶点与疾病相关靶点，研究针灸治疗疾病的作用机制。

在构建“针灸网络”和“疾病网络”基础上，还可以计算疾病最佳的针灸治疗方案和预测针灸临床新应用，例如根据某一疾病的疾病-蛋白-基因网络，通过对疾病的靶点基因进行反向推导，计算出改变这些靶点基因的针灸最佳治疗参数，即最佳的针灸治疗方案。同理，也可以通过对针灸-靶点基因网络进行分析，计算出靶点基因主要参与哪些疾病的发展过程，从而推导出针灸具有潜在治疗效应的疾病，预测针灸临床新应用，笔者在前期研究中，通过针灸作用靶点与疾病相关靶点计算出针灸潜在优势病症，针灸可能在肿瘤及免疫系统疾病中有较好疗效。

外泌体可以是针灸网络生物学研究的重要切入点

外泌体是由细胞内多囊泡体与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的脂质双分子膜包裹的小囊泡，携带了蛋白质、脂质、mRNA及microRNA等大量细胞内生物信息，是细胞间通讯的重要方式，也是神经、内分泌、免疫系统之间信息传递的重要载体。外泌体携带了大量生物活性物质，为许多疾病的早期诊断和治疗提供了生物学基础，例如胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、胃癌等。同时，外泌体也是针灸网络调节的重要载体，笔者团队前期研究初步发现外泌体可能在针刺的网络调节中发挥重要作用，针刺正常及佐剂型关节炎大鼠足三里穴均可介导外泌体的释放，拮抗穴区及循环外泌体可明显降低针刺镇痛效应，足底及腹腔回输外泌体则有“类针刺”效应。

同时，外泌体具有的普适性、多样性、保守性、特异性、靶向性等特点。外泌体的普适性是指外泌体是所有活细胞都能产生的微小囊泡，存在于机体各种体液中，这与针灸穴位信息广泛性具有相似的特点。针灸穴位广泛存在于机体各个部位，外泌体的普适性可能为穴位信息广泛性提供生物学基础。外泌体的多样性指其运载物质种类多，包括蛋白质、脂质、DNA、RNA等，这与针灸效应广谱性具有相似性。针灸刺激是个小刺激，但往往机体能产生大反应，针灸可能通过改变外泌体内含物质，达到级联放大针灸刺激的贡献，因此，外泌体的多样性可能为针灸效应广谱性 提供生物学基础。外泌体的保守性体现在其磷脂双分子膜结构中，外泌体的磷脂双分子膜结构使外泌体内含生物活性物质不易被降解，因此可以实现体液远距离运输，这与针灸的远治作用具有相似性。针灸四总穴歌云：“肚腹三里留，腰背委中求；头项寻列缺，面口合谷收”，远治作用是针灸的重要特点，也是针灸临床的重要方法，但是针灸是如何实现远治作用的现在并不清楚，而外泌体的保守性特点可能为针灸的远治作用提供生物学基础。外泌体的特异性指不同细胞释放的外泌体有不同的遗传物质和特异性膜蛋白，例如结肠上皮细胞来源的外泌体膜表面具有特异性 的A33蛋白，这与针灸经穴-脏腑相关理论具有相似性。针灸“经穴-脏腑相关”理论认为当机体内脏器官发生生理或病理性时改变，在体表特异部位有相应的反应，外泌体的特异性可能为针灸“经穴-脏腑相关”理论提供了生物学基础。外泌体具有靶向性，研究发现不同细胞分泌的外泌体拥有不同的整合素类型，从而靶向不同的器官，例如肿瘤可以向肝、肺等其他器官转移，原因在于外泌体表面有不同的整合素ITHa6β4及ITGa6β1，这与针灸“气至病所”特点具有相似性。《灵枢·九针十二原》中指出，“刺之要，气至而有效”，“气至病所”是针灸的又一大特点，可以实现针灸靶向治病，而外泌体的靶向性可能是实现针灸“气至病所”的生物学基础。

外泌体是针灸网络调节的重要载体，同时外泌体普适性、多样性、保守性、特异性、靶向性等特点与针灸的网络调节效应具有高度相关性，因此从外泌体入手研究针灸网络调节可能是针灸研究的重要突破口。

小结

针刺物理刺激这一基本属性，决定了网络调节是针灸作用基本作用模式，过往基于还原论方法进行的针灸研究揭示了部分作用机制，但尚不系统、全面。网络生物学将系统论和还原论相结合，将整体与局部相结合，通过模型构建，可以计算分析复杂的网络系统，可为针灸研究开辟新道路。在此基础上，我们提出“针灸网络生物学”是针灸学和网络生物学相结合而形成的新兴前沿交叉学科，符合针灸网络调节的特点，可以为解决针灸研究中的关键科学问题和提高针灸临床疗效提供创新思路与方法，有望取得突破性的进展。